自噬的分子標志物研究論文

時間：2023-02-01 23:30:15 論文我要投稿

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自噬的分子標志物研究論文

　　在生理狀態下, 細胞通過自噬 (autophagy) 清除衰老細胞器和突變蛋白, 以維持自身結構穩定和功能正常。自噬還參與胚胎發育、免疫調節等生理過程。病理狀態下細胞自噬水平顯著升高, 以耐受缺血、饑餓和凋亡等情況。此外, 自噬功能的障礙還會導致某些疾病的發生。根據細胞內底物運送到溶酶體腔的方式不同, 自噬可分為大自噬 (macroautophagy)、小自噬 (microautophagy) 、分子伴侶介導的自噬(chaperon-mediated autophagy, CMA)。此外, 還有些選擇性自噬如線粒體自噬 (mitophagy)、聚集體自噬 (aggrephagy)等。不同類型的自噬其發生過程不同,參與的蛋白分子也不同。檢測不同自噬過程中的分子標志物的水平、狀態與定位有助于評價細胞的自噬水平。

自噬的分子標志物研究論文

　　1 大自噬標志物

　　大自噬的囊泡膜結構起源于內質網和高爾基體等。這些膜片段形成杯狀結構, 包裹胞內物質并最終形成閉合的雙層膜的囊泡即自噬體, 然后自噬體與溶酶體融合, 自噬體內蛋白質或細胞器在溶酶體中被溶酶體酶降解。因此該過程的標志物包括自噬體囊泡形成過程的標志物、溶酶體標志物和自噬底物標志物三類。

　　1.1 自噬體標志物

　　自噬相關蛋白 (autophagy-related protein, Atg)是一類自噬組成蛋白, 參與調節自噬起始和延伸等過程。其中幾個關鍵蛋白, 也成為自噬標志物。

　　1.1.1 Atg12-Atg5 復合物Atg12 與Atg5 會形成復合物, 甚至在一些哺乳動物細胞中似乎所有Atg5和Atg12都表現為結合體的形式。Atg12-Atg5 復合物在自噬的形成中至關重要。此外, Atg12-Atg5 復合物還可以充當Atg8-磷脂酰乙醇胺 (phosphatidylethanolamine,PE) 結合系統的E3 樣連接酶。Atg12-Atg5 的缺失會導致自噬缺陷。但在短時饑餓狀態, Atg12-Atg5 的水平改變并不明顯。Atg12-Atg5 復合物的水平檢測可采用蛋白質印跡技術 (Western blot) 方法進行。Atg12 分子質量預期為15 kDa, 但在SDS-PAGE 膠上目測大約在19 kDa的位置上。Atg5 分子質量大約為32 kDa。由于Atg12分子質量小, 不易檢測, 并且Atg5 與Atg12 的結合是非可逆的, 因此可分別用Atg5 和Atg12 的抗體孵育,然后直接檢測Atg12-Atg5 的結合形式, 其分子質量大約在55 kDa 左右。

　　1.1.2 自噬相關16 樣蛋白1 (autophagy related 16-like 1, Atg16L1) Atg16L1 與Atg12-Atg5 復合物相互作用, 并以自身寡聚化的方式形成Atg12-Atg5-Atg16L1 復合物 , 附著在自噬體表面, 在自噬前體膜的延伸中發揮作用。在自噬前體膜完全融合形成封閉的自噬體后, Atg12-Atg5-Atg16L1 復合物被釋放到胞質中。在細胞膜轉移作為自噬膜供體的過程中, Atg16L1 可作為一個指標, 其定位在自噬體上,但在完整的自噬溶酶體膜上尚未見分布。因此,Atg16L1 可以用來檢測早期自噬體的形成。可對Atg5、Atg12 或Atg16L1 進行免疫透射電鏡和免疫染色的檢測。檢測內源性的Atg5、Atg12 或Atg16L1 所形成的點狀聚集或斑塊可監測自噬的改變。在生理情況下, 內源性蛋白主要是在胞漿中彌散分布的; 而在饑餓等環境應激下自噬被誘導, 則細胞中Atg5、Atg12 或Atg16L1 的點狀聚集或斑塊會明顯增加。

　　1.1.3 Atg8/微管相關蛋白1 輕鏈3 (microtubuleassociatedprotein1 light chain 3, LC3) Atg8/LC3是目前研究中被最廣泛使用的分子標志物。在酵母中, Atg8 與PE 偶聯形成Atg8-PE[5]。LC3 參與了自噬體膜的形成, 包括兩種可相互轉化的形式即LC3-I 和LC3-II。細胞內新合成的LC3 經過加工, 成為胞漿可溶形式的LC3-I, 后者經泛素化加工修飾, 與自噬體膜表面的PE 結合, 成為膜結合形式的LC3-II。LC3-II定位于前自噬體和自噬體, 是自噬體的標志分子, 隨自噬體膜的增多而增加。SDS-PAGE 電泳中, LC3-I 的表觀分子質量為18 kDa, LC3-II 的表觀分子質量為16 kDa。盡管PE偶聯形式的LC3-II 的分子質量較LC3-I 大, 但是其具有強疏水性, 因此在SDS-PAGE 中電泳遷移率反而比LC3-I (非PE 偶聯的LC3) 快。可以通過Western blot比較組間LC3-II 水平, 也可通過計算LC3-II/LC3-I的比值來評價LC3-II 水平, 并推測自噬囊泡數量的多少。LC3 在含SDS 的樣品裂解液中易降解, 因此樣品經煮沸裂解后應當盡快進行Western blot 實驗, 并避免反復凍融。LC3-II 的含量或LC3-II/LC3-I 的比例與自噬體的數量呈正相關, 在某種程度上反映了細胞的自噬活性。但是需要注意的是, 自噬是動態的, 自噬體的聚集可能是自噬活化待降解底物聚集而成, 也可能是自噬效應部分阻斷, 自噬體無法被清除導致的。因此僅評價自噬體數量或LC3-II 的表達均不能代表整個自噬過程。只有客觀地分析自噬動態變化才能準確地判斷自噬活性。基于自噬流 (autophagic flux) 的檢測成為反映自噬活性更為可靠的指標。

　　1.1.4 Atg9/mAtg9 Atg9 是所有Atg 蛋白中唯一的跨膜蛋白, 進化上高度保守, 在酵母以及哺乳動物細胞中都存在。酵母Atg9 存在于30～60 nm 的、來源于高爾基體膜的單層囊泡上, 這些Atg9 囊泡在胞漿快速運動, 并整合到自噬囊泡外膜上。哺乳動物細胞mAtg9 與自噬囊泡存在動態相互作用。在形成成熟自噬體后, mAtg9 并未整合進自噬體囊泡上, 而是又游離進入胞漿。有研究表明, mAtg9 在形成雙FYVE 結構域蛋白1 (double FYVE-containing protein 1, DFCP1)陽性的自噬體前體中是必需的, 但不依賴于早期的一些自噬蛋白如UNC-51 樣激酶1 (UNC-51-like kinase1, ULK1) 和磷酸肌醇相互作用蛋白2 (WD repeatdomain, phosphoinositide-interacting protein 2,WIPI2)。mAtg9 定位在內體和內體樣的部位, 推測其在多種細胞器如再循環的內體間活動, 在自噬的起始進程中發揮極為關鍵的作用。mAtg9 可用來檢測自噬的發生。

　　1.1.5 Atg6/Beclin1 哺乳動物Beclin1 是酵母Atg6/液泡分選蛋白30 (vacuole protein sorting 30,Vps30) 基因的同源物。Beclin1 主要定位于反面高爾基體 (trans-Golgi network, TGN)、內質網和線粒體。Beclin1 與Vps34 形成III 型磷脂酰肌醇3 激酶復合物 (phosphatidylinositol 3-kinase Class IIIcomplex, PI3KC3) 。Vps34 可磷酸化磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol, PI) 生成3-磷酸磷脂酰肌醇(PI3-phosphate, PI3P), 而PI3P 募集胞漿中其他自噬相關蛋白Atg 結合到前自噬體膜上, 在自噬體形成早期發揮重要作用。磷脂酰肌醇3 激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K) 抑制劑可干擾自噬體的形成。此外, Bcl-2 與Beclin1 結合也可抑制自噬活性。用熒光顯微鏡或透射電鏡可檢測Beclin1-GFP 的點狀聚集或斑塊作為自噬標志物。但Beclin1 自身有核定位信號, 且GFP 融合蛋白的定位受到GFP 的干擾, 因此Beclin1-GFP 熒光顯微結果顯示有核定位傾向, 可能會影響對自噬狀態的評判。在Beclin1 依賴的自噬中, PI3K 活性在自噬體形成中至關重要, 因此在Beclin1 免疫沉淀物中測定PI3K 活性可用來監測其對自噬的調節影響。

　　1.1.6 Atg14/Barkor Atg14 定位在自噬體上, 其羧基端被命名為BATS (barkor autophagosome targetingsequence) 區域。BATS 區域在Beclin1 招募和自噬活化中意義重大。Atg14 的BATS 區域通過α 螺旋的疏水表面與自噬囊泡膜結合。在應激情況下, BATS 點狀聚集或斑塊與Atg16 和LC3 以及部分自噬早期標志物DFCP1 重合。Atg14-GFP 或BATS-GFP 在用熒光顯微鏡或投射電鏡技術檢測自噬水平時可作為自噬標志物。但除了定位于自噬體, Atg14 也定位于自噬溶酶體和內質網上。因此, 用Atg14 作為標志物時最好也結合用其他自噬標志物做鑒定。

　　1.1.7 損傷調節自噬蛋白 (damage-regulated autophagymodulator 1, DRAM1) DRAM1 是一個具有六個跨膜結構的疏水蛋白。除了定位于順面高爾基體, DRAM1 也定位于早期和晚期內體和溶酶體, 它與早期核內體相關蛋白1 (early-endosome-associatedprotein 1, EEA1) 和溶酶體相關膜蛋白2 (lysosomeassociatedmembrane protein type 2, LAMP-2) 共定位。在應激情況下, DRAM1 可被活化的p53 激活。DRAM1 基因沉默會阻斷自噬的發生。由于DRAM1分子質量很小, 大約28 kDa, 加之其疏水性強, 蛋白水平檢測有一定難度, 可考慮用實時定量PCR 對其mRNA 水平進行檢測。

　　1.1.8 ZFYVE1/DFCP1 鋅指FYVE 結構域蛋白1(zinc finger FYVE domain-containing protein 1, ZFYVE1)也被稱為雙FYVE 結構域蛋白1 (DFCP1), 其羧基端即為兩個鋅結合的FYVE 結構域。FYVE 結構域參與膜轉運和細胞信號, 促進其與含PI3P 的膜結合。ZFYVE1/DFCP1 與PI3P 結合后, 定位于內質網和高爾基體。饑餓誘導DFCP1 轉位至粗面內質網的粗粒上, 顯示在歐米茄體 (omegasome) 形成的部位。因此DFCP1 可作為自噬形成初期的標志物。DFCP1的表達可用熒光免疫組化方法觀察, 出現DFCP1 陽性的點狀分布則意味著自噬囊泡正在開始形成期。

　　1.2 溶酶體標志物

　　因為自噬過程最終的完成是在溶酶體中進行的,因此溶酶體標志蛋白在自噬功能研究中就顯得極為重要。在酸性水解酶的作用下, 進入溶酶體的自噬體內容物被降解。降解生成的可溶性小分子物質經自噬溶酶體膜滲透入細胞質, 參與細胞的物質代謝活動。目前已識別的25 個溶酶體膜蛋白都是高糖基化的。含量最高的膜蛋白就是溶酶體相關膜蛋白1(lysosome-associated membrane protein type 1, LAMP-1)、LAMP-2 和溶酶體整合膜蛋白 (lysosomal integralmembrane protein, LIMP-2)。可用免疫組化或Western blot 的方法檢測溶酶體重要膜蛋白的水平,并與其他自噬相關蛋白結合使用。

　　1.3 自噬底物

　　p62 也被稱為SQSTM1, 在多種細胞和組織中都有表達, 可作為一個貨車蛋白參與多種信號轉導過程。p62 可連接LC3 和泛素化的底物, 隨后被整合到自噬體中, 并在自噬溶酶體中被降解。當自噬被激活時自噬體與溶酶體融合, 自噬囊泡中p62 等蛋白或細胞器被溶酶體酶降解, p62 水平降低; 當自噬被抑制時自噬體積累, p62 水平升高。因此, 可以用Western blot 方法檢測p62 的水平, 作為自噬能力變化的指征。

　　除了與LC3 和泛素化蛋白結合外, p62 可能還參與形成雷帕霉素靶蛋白復合物 (target of rapamycincomplex 1, TORC1)。p62 還與蛋白酶體功能相關。當蛋白酶體功能被抑制時, p62 水平也會增高。此外,p62 也是鈣依賴的非溶酶體蛋白酶calpain 1 的底物,因此很難解釋它在自噬與死亡檢測中的意義。在自噬被激活時, LC3 的上調和p62 的表達下降不一定有明顯的關聯。盡管p62 可以作為自噬損害或者自噬流改變的輔助標志, 但最好聯合其他指標如LC3 進行自噬流的評估。

　　2 CMA 的標志物

　　CMA 是胞漿內某些蛋白質被分子伴侶如熱休克蛋白質70 (heat shock cognate protein of 70 kDa,HSC70) 識別, 并將其運送到溶酶體膜上, 再經溶酶體膜蛋白LAMP-2a 結合后被轉運到溶酶體腔中被溶酶體酶消化的過程。與大自噬和小自噬相比,CMA 的主要特點是細胞質內的蛋白質直接經溶酶體膜蛋白轉運入溶酶體腔, 不需形成自噬囊泡。

　　2.1 HSC70

　　HSC70 是分子質量為70 kDa 的熱休克同源蛋白,它是分子伴侶, 在胞漿識別帶有KFERQ 樣序列的CMA 底物。HSC70 與定位于溶酶體腔面的Hsp90 相互作用。在HSC70 的幫助下, 底物在穿越溶酶體膜時開始從折疊狀態去折疊, 并在LAMP-2a 復合物形成之前完成。將底物轉運穿越溶酶體膜還需要定位在溶酶體膜上的HSC70 (lys-HSC70)。HSC70 的穩定性依賴于溶酶體的pH 值。pH 值輕微的上升都會促進HSC70 的降解。

　　2.2 LAMP-2a

　　LAMP-2 有3 個亞型, LAMP-2a、LAMP-2b 和LAMP-2c, 借助RNAi 技術顯示只有LAMP-2a 才是CMA 途徑重要的受體。CMA 的速率直接依賴于溶酶體膜上LAMP-2a 的含量。LAMP-2a 在胞內的水平可由于轉錄水平改變或降解速率改變而發生變化。抑制LAMP-2a 將引起CMA 底物GAPDH 的聚集; 過表達LAMP-2a, 則引起GAPDH 水平下降。

　　3 線粒體自噬標志物

　　線粒體自噬指在ROS、營養缺乏和細胞衰老等內外環境的刺激下, 細胞內的線粒體發生去極化, 而這些被損傷的線粒體將被特異性地包裹進自噬體中并與溶酶體融合, 從而完成損傷線粒體的降解, 維持細胞內環境穩定的過程。細胞主要通過選擇性自噬來進行線粒體的更新。損傷的線粒體在發生線粒體自噬之前先發生動力相關蛋白1 (dynamin-related protein 1, DRP1) 介導的線粒體分裂。線粒體膜電位的下降引起PTEN 誘導假定激酶 (phosphatase and tensin homolog-inducedputative kinase 1, PINK1) 的聚集, 接著招募E3 泛素連接酶Parkin 到線粒體。Parkin 促進線粒體膜上蛋白質泛素化, p62 蛋白與線粒體上泛素化蛋白相互作用,借助p62 與LC3 的互作引導線粒體被自噬體包裹。同時, 線粒體上存在自噬受體如BNIP3 (Bcl-2 andadenovirus E1B 19-kD interacting protein 3) 和NIX/BNIP3L (BNIP3-like) 也可以與LC3 互作使得受損線粒體通過自噬方式被去除。研究中通常用線粒體標志物和自噬標志物LC3共定位來顯示線粒體自噬。此外, 還有幾個線粒體自噬受體也可以考慮用作線粒體自噬的標志。

　　3.1 Atg32

　　酵母中, Atg32 是一個分子質量約59 kDa 的跨膜蛋白, 定位在線粒體外膜上。在氨基端有與Atg8 和Atg11 結合的結構域, 在線粒體自噬的發生中作用巨大。Atg11 是個腳手架蛋白, 在選擇性自噬中為Atg蛋白的裝配提供平臺。羧基端可能發揮調節線粒體自噬的作用。抑制Atg32 表達會減少線粒體自噬的效率,同樣地, 過表達Atg32 則增加線粒體自噬的效率。研究認為Atg32 是酵母線粒體自噬發生的限速步驟。進一步的研究發現酵母中Atg32 缺失并不明顯影響普遍意義上的自噬, 因此認為Atg32 是引導線粒體自噬專屬分子。盡管線粒體自噬是進化上保守的現象,但是在哺乳動物細胞中并未發現Atg32 的同源基因。

　　3.2 BNIP3 和NIX

　　BNIP3 和NIX 序列上有56% 的同源度, 且都有BH3 結構域, 并與Bcl-2 作用。NIX 與BNIP3 定位在線粒體和內質網上, 通過影響線粒體呼吸和ROS 水平調節凋亡和程序性壞死。BNIP3 插入線粒體的外層膜,其氨基端在胞漿中, 而羧基端在線粒體內。BNIP3 誘導線粒體嵴消失并促進細胞色素C 釋放, 同時, NIX和BNIP3 包含有與LC3 結合的LC3 相互作用區域(LC3-interaction region, LIR), 因而也被稱為是線粒體自噬受體。BNIP3 的17 位絲氨酸和24 位絲氨酸的磷酸化會促進其與LC3 結合, 易化線粒體自噬的發生。NIX 與Ras 家族小GTPase—Rheb 互作促進線粒體自噬。此外, NIX 可促進Parkin 定位到受損線粒體上, Parkin 又對線粒體膜上蛋白質進行泛素化, 從而引導p62 與LC3 的互作而發生線粒體自噬。

　　4 小結

　　自噬標志物的檢測在自噬研究中發揮了巨大的作用, 使得人們可以簡便、動態、實時并定量地檢測細胞內自噬水平。然而單獨檢測每一種自噬標志物都有一定的局限性和影響因素, 在研究自噬時必須慎重考慮研究條件, 適當設置陰性與陽性對照, 使用多種自噬抑制劑或者基因沉默等技術, 多方面、多層次進行實驗以確認細胞的自噬水平。

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