利用CRISPR研究基因組“暗物質(zhì)”的論文
超過(guò)98%的人類基因組由非編碼基因組成。這些非編碼基因被稱為基因組的“暗物質(zhì)”，它們能調(diào)控編碼基因的表達(dá)，從而影響人類健康和疾病進(jìn)程。自從人類基因組序列被公開(kāi)發(fā)表以來(lái)，科學(xué)家們努力解析基因中的功能元件，包括非編碼調(diào)節(jié)區(qū)——參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的順式調(diào)節(jié)區(qū)和非編碼RNA（ncRNA）。轉(zhuǎn)錄因子在整個(gè)基因組中可能有數(shù)百至數(shù)千個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，因此研究起來(lái)非常復(fù)雜。目前常用的兩種研究轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因表達(dá)位點(diǎn)的方法是：1，耗時(shí)且復(fù)雜的增強(qiáng)子研究；2，在非天然狀態(tài)中克隆增強(qiáng)子或啟動(dòng)子序列，開(kāi)展并行研究。最近Sanjana等人和Fulco等人的研究都指出，可以利用CRISPR技術(shù)在天然狀態(tài)里研究非編碼調(diào)控元件的功能。
大規(guī)模的生化試驗(yàn)使人們發(fā)現(xiàn)了由潛在的、被數(shù)百種蛋白靶向結(jié)合的調(diào)節(jié)序列。值得一提的是，識(shí)別脫氧核糖核酸酶I超敏感位點(diǎn)（deoxyribonuclease I hypersensitive site， DHS）和大規(guī)模染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（chromatin immunoprecipitation–sequencing， ChIP seq）方法的提出，讓科學(xué)家們能夠全面地解析蛋白與染色質(zhì)結(jié)合的情況。然而，把這些分子和功能調(diào)控聯(lián)系起來(lái)非常困難。
由于使用不同的CRISPR載體可以無(wú)偏向性地敲除蛋白編碼基因，因此CRISPR篩選是研究非編碼基因功能的有力工具。與人類細(xì)胞中NGG（前間區(qū)序列鄰近基序）序列上游的基因序列同源的單引導(dǎo)RNA（single guide RNA， sgRNA）可以引導(dǎo)CRISPR系統(tǒng)到達(dá)特定基因組位點(diǎn)，從而特異性地引起突變。首個(gè)CRISPR“敲除”篩選研究在基因組規(guī)模上誘導(dǎo)了全基因敲除，并克服了RNA干擾篩選中的諸多限制，例如脫靶效應(yīng)和敲除不完全（圖：CRISPR-Cas9篩選方法）。
Sanjana等人使用CRISPR工具來(lái)研究黑色素瘤細(xì)胞中調(diào)控vemurafenib（B-Raf蛋白V600E突變中，600位點(diǎn)的纈氨酸被谷氨酸所替代，而Vemurafenib抑制攜帶了V600E突變的B-Raf蛋白中的絲氨酸 – 蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域）抗性的序列。研究人員使用CRISPR工具靶向主要的抗性調(diào)節(jié)區(qū)域——NF1（neurofibromatosis type 1，神經(jīng)纖維瘤病1型基因）、NF2（neurofibromatosis type 2，神經(jīng)纖維瘤病2型基因）和CUL3（cullin 3，泛素連接酶3）。該方法中，向?qū)NA和反式激活crRNA（trans-activating crRNA）融合，引導(dǎo)來(lái)源于釀膿鏈球菌的Cas9（spCas9）在目標(biāo)位點(diǎn)處誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂，從而產(chǎn)生突變。結(jié)果顯示，靶向CUL3的sgRNA在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)最為富集。sgRNA富集的.區(qū)域，CUL3被敲除，這表明，CUL3似乎與染色體相互作用、組蛋白翻譯后修飾，以及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)阻斷的調(diào)控區(qū)域相關(guān)。
Fulco等人利用CRISPR干擾系統(tǒng)，即利用失活的Cas9和KRAB蛋白融合，沉默靶向序列的表達(dá)。這種方法雖然實(shí)現(xiàn)了靶向性的基因沉默，但并未引起基因突變。研究者們?cè)O(shè)計(jì)的靶向序列圍繞在MYC和GATA1基因附近（這兩個(gè)基因能調(diào)控K562紅白血病細(xì)胞的增殖）。他們首先使用病毒感染細(xì)胞，將CRISPRi系統(tǒng)載帶進(jìn)入細(xì)胞，然后使用多西環(huán)素誘導(dǎo)dCas9靶向目標(biāo)序列。他們發(fā)現(xiàn)，sgRNA富集點(diǎn)恰好和包含多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的DHS重合。更有趣的是，dCas9靶向GATA1或組蛋白脫乙酰酶6（HDAC6）增強(qiáng)子時(shí)，都會(huì)減少HDAC6表達(dá)。這表明，對(duì)于共同的增強(qiáng)子（GATA1和HDAC6存在共同的增強(qiáng)子），基因之間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。鑒定出來(lái)的MYC增強(qiáng)子的位置與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、CCCTC-結(jié)合因子（CTCF，介導(dǎo)染色質(zhì)相互作用）結(jié)合位點(diǎn)都是吻合的。這可能是MYC調(diào)控細(xì)胞增殖的機(jī)制。
雖然CRISPR-spCas9和CRISPRi篩選方法都成功識(shí)別了非編碼調(diào)節(jié)元件，但CRISPRi只能用于轉(zhuǎn)錄抑制，鑒于不同基因之間的轉(zhuǎn)錄抑制是不同的，CRISPR不一定能適用于其它基因的轉(zhuǎn)錄抑制。但總的來(lái)說(shuō)，這兩項(xiàng)研究都證明了CRISPR在研究非編碼調(diào)控網(wǎng)絡(luò)上的潛力。此外，研究已經(jīng)證實(shí)，雖然非編碼基因的突變只能造成微小的基因表達(dá)變化，但可以造成大的表型變化，這意味著CRISPR篩選也可以推廣到其它疾病的表型測(cè)定上。盡管全基因組關(guān)聯(lián)研究已經(jīng)鑒定出致病的生殖細(xì)胞突變，但是系統(tǒng)性研究致病的體細(xì)胞突變中的非編碼調(diào)控元件突變也具有重要意義。例如，研究表明，一些疾病的發(fā)病原因是特定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)增加的突變、基因重組造成的融合事件、ncRNA造成的突變，以及偽基因。對(duì)這些非編碼調(diào)控元件的研究能加深我們對(duì)疾病發(fā)生、發(fā)展的理解，從而促進(jìn)臨床手段的研發(fā)。
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