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分離培養(yǎng)及鑒定骨髓間充質干細胞的方法探析論文
骨髓間充質干細胞（BMSCs）也被稱為間質祖細胞，由于其巨大的增殖和多向分化潛能，被認為是再生醫(yī)學、基因治療和細胞治療的理想種子來源，已被廣泛進行研究[1-3].目前，BMSCs在動物實驗和臨床應用上取得了巨大的成果，在骨、軟骨、肌腱、神經膠質修復、心臟疾病、心肌梗塞、肝臟損傷等方面取得了重大突破[4-6],并且可避免胚胎干細胞和異基因干細胞治療所涉及的倫理道德和免疫排斥問題，有利于細胞移植。但是骨髓中的BMSCs含量極少，約占骨髓全細胞的0.001%~0.010%[7];因此，需要在體外分離純化、培養(yǎng)擴增來滿足臨床應用和實驗研究。研究表明，不同分離方法和首次換液方式對BMSCs的增殖培養(yǎng)有很大的影響[8].本試驗通過觀察2種不同分離方法和不同首次換液時間對兔BMSCs生物活性的影響，旨在建立一種有效的分離培養(yǎng)及鑒定BMSCs的方法，以便獲得大量、高純度、高活性、培養(yǎng)周期短的BMSCs,為下一步研究和臨床實驗提供基礎。
1 材料與方法
1.1實驗動物1月齡雄性新西蘭大耳白兔1只，由河南省實驗動物中心提供。
1.2主要試劑和儀器胎牛血清（北京四季青）；DMEM-F12（Gibco）；胰蛋白酶（北京拜爾迪生物公司）；DMSO（Gibco）；紅細胞裂解液（北京賽馳生物技術有限公司）；生物素標記山羊抗兔IgG、HRP標記鏈霉親和素、DAB顯色試劑盒、改良型蘇木素（北京華肽先鋒）；兔抗兔CD34、CD44、CD99抗體（北京博奧森）；封閉山羊血清（北京博奧森）。
HF151UV型CO2培養(yǎng)箱（Heal Force）；倒置顯微鏡（Leica）;800型離心機、85-2恒溫磁力攪拌器：金壇市大地自動化儀器廠；數(shù)碼相機：日本佳能IXUS 980IS;電子天平：METTLER TOLEDO AL104;超凈工作臺：AIR TECH;FX101-2型電熱鼓風干燥箱：上海樹立儀器儀表有限公司；pH計：上海雷磁儀器廠。
1.3 BMSCs的提取用陸眠寧（846）將1月齡新西蘭大耳白兔麻醉，腿部去毛消毒，無菌條件下分離股骨、脛骨，剔除脂肪和肌肉，PBS液反復沖洗，剪斷兩側干骺端，盡量多保留干骺端，DMEM-F12培養(yǎng)液反復沖洗骨髓腔于A、B兩個10mL的離心管內，直至骨髓腔發(fā)白，1 000r/min離心5min,棄上清。
1.4全骨髓貼壁法A管用PBS重懸細胞，1 000r/min離心5min洗滌2次，棄上清。吸取3mL含10%FBS的DMEM-F12（1∶100雙抗）培養(yǎng)液重懸細胞，接種至3個25cm2培養(yǎng)瓶，補足培養(yǎng)液至5mL,輕柔吹打均勻。置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。以后每3d換液1次，待細胞生長融合至80%時傳 代 培 養(yǎng)。 先 棄 去 舊 培 養(yǎng) 液，PBS液 浸 洗。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA,37℃條件下孵育3min,含血清的DMEM-F12終止消化。以1∶2的比例傳代培養(yǎng)，每3d換液1次。每天在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。
1.5紅細胞裂解法B管加入1mL紅細胞裂解液重懸細胞，靜置1~3min,待液體由紅色變?yōu)榘咨螅?入5 mL PBS液，1 000r/min離 心2次，5min/次，棄 上 清。 吸 取3 mL含10% FBS的DMEM-F12（1∶100雙抗）培養(yǎng)液重懸細胞，接種至3個25cm2培養(yǎng)瓶，補足培養(yǎng)液至5mL,輕柔吹打均勻。置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。
2d后首次換液，以后每3d換液1次，待細胞生長融合至80%時傳 代 培 養(yǎng)。 先 棄 去 舊 培 養(yǎng) 液，PBS液 浸 洗。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA,37℃條件下孵育3min,含血清的DMEM-F12終止消化。以1∶2的比例傳代培養(yǎng)，每3d換液1次。每天倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。
1.6兔BMSCs細胞活性檢測及生長曲線繪制培養(yǎng)48h時，各取一瓶細胞，棄去培養(yǎng)基，用PBS沖洗2遍，倒置顯微鏡下觀察細胞。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化后，0.4%臺盼藍染色，血球計數(shù)板計數(shù)活細胞（未著色）和死細胞（著色細胞）。分別計算出2種不同分離方法的細胞活性。上述試驗重復3次。
選取生長良好的P1、P3和P8代細胞，以2.0×104個/孔，接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1mL,每3d換液1次，每隔1d取3孔，消化后計數(shù)，取其平均值為當天的細胞數(shù)，連測8d,以培養(yǎng)時間為橫坐標，細胞數(shù)為縱坐標，繪制細胞生長曲線。
1.7首次換液時間對兔BMSCs的影響將用紅細胞裂解法分離得到的兔BMSCs按首次換液時間隨機分為4組：12h換液組、24h換液組、48h換液組、72h換液組，以后每3d換液1次，記錄傳代前各組0~3代各代培養(yǎng)時間，各代細胞均保留3瓶。
1.8細胞免疫組化鑒定兔BMSCs收集紅細胞裂解法的P3代細胞，制備細胞爬片，常規(guī)SABC免疫組織 化 學 方 法 檢 測 表 面 抗 原CD34、CD、CD45、CD90的表達。
1.9統(tǒng)計學處理所得數(shù)據以均數(shù)±標準誤表示，應用SPSS16.0統(tǒng)計學軟件進行處理，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），用Microsoft Excel軟件作圖。
2 結果
2.1不同分離方法對兔BMSCs形態(tài)和生長的影響
剛接種時，2種不同分離方法所得的原代細胞在倒置顯微鏡下觀察細胞呈圓形，大小一致，折光性強，不容易區(qū)分。培養(yǎng)48h后，A、B兩組細胞均可看見有圓形、短梭形、多角形細胞貼壁。
B組貼壁細胞較A組細胞多（圖1）。臺盼藍染色檢測細胞活性全骨髓貼壁法（A組）為90%,紅細胞裂解法（B組）為96%.隨著培養(yǎng)的繼續(xù)，大量細胞貼壁，并出現(xiàn)典型的BMSCs細胞集落，緊密排列。
A組細胞生長較緩慢，所得細胞純度較低；B組細胞生長較快，純度較高。原代細胞達到傳代的時間A組為10.2d,B組為7.2d,差異顯著（P<0.05）。B組細胞P3代細胞呈旋渦狀或放射狀生長，細胞形態(tài)大小均一（圖2）.
2.2兔BMSCs生長曲線繪制
通過細胞計數(shù)法繪制細胞生長曲線，對兔BMSCs的生長特性進行鑒定。結果顯示，P1、P3、P8代細胞培養(yǎng)過程中，細胞生長具有相似的特點：1~2d細胞處于潛伏期；3~6d細胞處于對數(shù)生長期；6~8d生長逐漸減慢，開始進入平臺期（圖3）。傳代細胞生長相對穩(wěn)定，隨著傳代次數(shù)的增加，細胞會出現(xiàn)衰老的特征，增殖速度減慢。
2.3兔BMSCs的鑒定
結果顯示，CD44、CD90抗原表達陽性，CD34抗原表達陰性（圖4），符合BM-SCs表面分子標記特征。
2.4首次換液時間對兔BMSCs培養(yǎng)周期的影響紅細胞裂解法分離兔BMSCs,分別在12,24,48,72h首次換液，結果（表1）顯示，24h換液組P0、P1、P2、P3代以及總時間的細胞培養(yǎng)時間與其他各組比較差異極顯著（P<0.01），表明24h首次換液可縮短細胞培養(yǎng)周期。
3 討論
骨髓中BMSCs的含量很低，一般為0.001%~0.010%,其數(shù)量和生長能力與年齡呈顯著負相關，想要在臨床實踐中利用BMSCs,就必須實現(xiàn)其在體外的分離培養(yǎng)和擴增。目前，常用的BMSCs的分離和純化方法有：全骨髓貼壁法、紅細胞裂解法、密度梯度法、免疫磁珠分選法和流式細胞術分選法，后2種方法篩選BMSCs的分選效率和純度均較高，但是對實驗條件和設備要求較高，費 用 昂 貴，并 且BMSCs表面缺乏特異性標志，在具體操作過程中可造成細胞的損傷和死亡，所以較少使用[9].密度梯度法由于分離液往往對BMSCs有一定的損傷，且離心會丟失大量的細胞，對細胞活性有影響，因此應用受到很大限制[10].本試驗通過比較全骨髓貼壁法和紅細胞裂解法，發(fā)現(xiàn)2種分離方法均可得到較均一的長梭形細胞，聚集成旋渦狀均勻生長。但是紅細胞裂解法分離得到的BMSCs在48h時貼壁細胞顯著多于全骨髓貼壁法，并且細胞活性較高，細胞密度達到80%融合，首次傳代時間也較短。這可能是因為全骨髓貼壁分離法保留了造血干細胞和其他雜細胞，在體外培養(yǎng)過程中混雜的細胞會對BMSCs的生長及貼壁產生影響，所得BMSCs純度和細胞活性均較低；而紅細胞裂解液的有效成分是氯化銨，能夠利用紅細胞的滲透脆性特異性的破壞無核紅細胞膜而去除紅細胞和血小板，并且對有核細胞無影響，從而去除骨髓中含量最高的細胞成分，經紅細胞裂解液處理后，減小了雜細胞對其貼壁的影響，為BMSCs貼壁保留了空間，有利于BMSCs的早期貼壁[11],所得細胞純度高，且細胞活力不受影響。因此，利用紅細胞裂解法，能夠在較短的時間里獲得大量的高純度、高活性的目的細胞，是一種有效的分離純化BMSCs的方法。
有研究表明，首次換液時間對BMSCs的生殖增長有一定的影響。原代首次換液時間過早，由于骨髓沖洗液中其他細胞分泌滋養(yǎng)BMSCs的生長因子等多種有益成分丟失，貼壁細胞數(shù)量減少，細胞生長緩慢，細胞培養(yǎng)周期延長；原代首次換液時間過晚，雜質貼壁緊密，細胞代謝產物等有害成分增多，造血干細胞分泌的生長因子使BMSCs出現(xiàn)分化等，從而導致細胞增殖周期延長。本試驗分別在12,24,48,72h首次換液，24h換液組，首次傳代時間及細胞培養(yǎng)總周期與其他各組比較，差異有顯著性意義，能顯著縮短細胞培養(yǎng)時間，因此，培養(yǎng)24h首次換液為最佳首次換液時間。
BMSC目前還沒有發(fā)現(xiàn)特異性的表面標記物，其鑒定尚無統(tǒng)一標準。
BMSC的表面抗原具有非專一性，表達內皮細胞、間質細胞、表皮細胞和肌肉細胞的表面標志，它包括（1）粘附分子CD44、CD105、CD166、CD54、CD102等；（2）整 合 素 家 族 成 員CD29、CD104、CD49a等；（3）其他CD90等[12-14].不表達造血干細胞表面標志，如CD34、CD45、CD11b、CD11a等[15-16].BMSCs,結 果 顯 示，BMSCs陽 性 表 達CD90和CD44,造 血 干 細 胞 標 志CD34呈 陰 性 表 達，符 合BMSCs的表面標志物特征，證實我們體外分離培養(yǎng)的細胞為純化的BMSCs.
綜上所述，通過紅細胞裂解液法分離得到的兔BMSCs生長增殖旺盛，生物學性狀穩(wěn)定，于培養(yǎng)24h首次換液可顯著縮短細胞的培養(yǎng)周期，便于后續(xù)的試驗研究。
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